プロトコル (2月 2020)

げっ歯類の不安関連行動のアッセイとしての高架式十字迷路の使用

げっ歯類の不安関連行動のアッセイとしての高架式十字迷路の使用

抽象 高架式十字迷路は、げっ歯類で広く使用されている行動アッセイであり、薬物とステロイドホルモンの抗不安効果を評価し、不安関連行動の根底にある脳領域とメカニズムを定義するために検証されています。 簡単に説明すると、ラットまたはマウスを迷路の4本の腕の接合部に置き、開いた腕に向かい、各腕の進入/持続時間をビデオ追跡システムと観察者が同時に5分間記録します。 他の動物行動学的パラメーター(すなわち、後部、頭部の窪み、および伸ばされた姿勢)も観察することができます。 開いた腕の活動(期間および/またはエントリ)の増加は、抗不安行動を反映しています。 私たちの研究室では、ラットまたはマウスが1回、プラス迷路にさらされています。 したがって、結果はげっ歯類あたり5分で得ることができます。 前書き 高架式十字迷路は、Fileと同僚 1 によって、げっ歯類の不安反応を評価する簡単な方法として説明されています。 高い接近回避回避の対立を生む高架開放路地と、そうでない閉鎖路地を含むY字型装置を使用したタスクは、Montgomery 2 によって最初に記述されました。 このタスクは、プラスの形状を形成するように配置された4本のアーム(2本のオープンと2本の囲まれた)を持つ高架迷路に変更され、HandleyとMithani 3 によって説明されました。 これらの著者は、閉じた腕に費やした時間に対する開いた

マウス胚性幹細胞から定義された均一なCNS前駆細胞およびニューロンの集団の生成

マウス胚性幹細胞から定義された均一なCNS前駆細胞およびニューロンの集団の生成

抽象 マウス胚性幹(ES)細胞からグルタミン酸作動性ニューロンの本質的に純粋な集団の生成を可能にする詳細なプロトコルが記載されています。 ES細胞の培養に基づいており、ES細胞は繰り返し分裂することにより未分化に保たれ、その後非接着細胞凝集体として増幅されます。 レチノイン酸での治療により、これらのES細胞は本質的にPax6陽性放射状グリア細胞の特徴を持つ神経前駆細胞になります。 それらが in vivo で行うよう に 、これらの前駆細胞は、機能的なシナプス接触を形成し、長期間培養で維持できるグルタミン酸作動性錐体ニューロンで分化します。 このプロトコルは、耐性マーカーまたは蛍光マーカーを発現するES系統の使用を必要としないため、原則として、対象の野生型または突然変異ES系統に適用できます。 ES細胞の培養を開始してから前駆細胞を播種し、ニューロンを分化させてから約10日以内にシナプス伝達が確立されるまで、少なくとも2週間が必要です。 前書き 神経生物学における重要な問題は、関連する培養システムの欠如であり、中枢神経系(CNS)の有糸分裂後のプロセスを担うニューロンの特性を反映する定義された細胞集団の生成を可能にします。 30年以上にわたるPC12細胞のユニークな成功は、末梢神経系(PNS)の神経分化の生化学に関連する疑問を研究するのに、細胞培養システムがどれほど有用であるかを示し

正誤表:マウスで繰り返される社会的敗北ストレスのための標準化されたプロトコル

正誤表:マウスで繰り返される社会的敗北ストレスのための標準化されたプロトコル

元の記事は2011年7月21日に公開されました Nat。 プロトタイプ。 6、1183–1191(2011); doi:10.1038 / nprot.2011.361; 2011年7月21日にオンラインで公開。 印刷後に修正2014年12月17日 最初に発行されたこの記事のバージョンでは、「さらに、獣医の継続的な評価の下で、必要なすべての施設内審査委員会と基準の完全な承認の下で敗北を実行すべきです」という文の解釈に関して多少の混乱がありました。 「さらに、必要なすべての機関の審査委員会と標準の完全な承認を得て敗北を実行する必要があります」と読むように変更されました。 著者 次の場所でSam A Goldenを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar 次でハーバートEコビントンを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Olivier Bertonを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Scott J Russoを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar コメント コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。 不

細胞質分裂ブロック小核サイトムアッセイ

細胞質分裂ブロック小核サイトムアッセイ

この記事は更新されました 抽象 細胞質分裂ブロック小核サイトムアッセイは、DNA損傷、細胞増殖抑制、細胞毒性を測定するための包括的なシステムです。 DNA損傷イベントは、一度分割された二核(BN)細胞で特異的に記録され、(a)小核(MNi)、染色体切断および/または全染色体喪失のバイオマーカー、(b)核質架橋(NPB)、DNAのバイオマーカーが含まれます誤修復および/またはテロメア末端融合、および(c)核芽(NBUD)、増幅DNAおよび/またはDNA修復複合体の除去のバイオマーカー。 細胞増殖抑制効果は、単核細胞、二核細胞、および多核細胞の割合によって測定され、壊死細胞および/またはアポトーシス細胞の比率によって細胞毒性が測定されます。 MNi、NPB、およびNBUDの形成につながるメカニズムに関する詳細情報は、セントロメアおよび/またはテロメアプローブを使用して取得します。 このアッセイは 、in vivo 遺伝毒性曝露のバイオモニタリング 、in vitro 遺伝毒性試験、ニュートリゲノミクスやファーマコゲノミクスなどのさまざまな研究分野に加え、正常組織および腫瘍の放射線感受性と癌リスクの予測因子に適用されています。 手順が完了するまでに最大5日かかることがあります。 前書き MNiは、核分裂中に後期に遅れる染色体断片または染色体全体に由来します(図1) 1, 2, 3, 4,

発現タンパク質ライゲーションによる大腸菌リボヌクレオチド還元酵素のR2サブユニットへのフルオロチロシンの部位特異的取り込み

発現タンパク質ライゲーションによる大腸菌リボヌクレオチド還元酵素のR2サブユニットへのフルオロチロシンの部位特異的取り込み

抽象 発現タンパク質ライゲーション(EPL)は、NまたはC末端にプローブまたは非天然アミノ酸を部位特異的に取り込むことにより、標的タンパク質の半合成を可能にします。 ここでは、EPLを使用して 大腸菌 リボヌクレオチド還元酵素の小サブユニットの残基356にフルオロチロシン(F n Ys)を組み込むために私たちの研究室が開発したプロトコルについて説明します。 この手順では、タンパク質の大部分(375のうち1〜353残基)をインテインドメインに融合し、組換え発現によって調製し、チオエステルで活性化された切断型のタンパク質を生成します。 タンパク質の残りの22-merペプチドは、固相ペプチド合成により調製され、所望の位置にF n Yを含みます。 22 merペプチドのチオエステル活性化R2へのライゲーションとその後の精製により、残基356にF n Yを持つ完全長R2が得られます。100mgの量のY 356 F n Y-R2を生成する手順には3〜4か月かかります。 前書き 調査中の問題 大腸菌 リボヌクレオチド還元酵素(RNR)は、4つのヌクレオチドすべての対応する2'-デオキシヌクレオチドへの変換を触媒し、2つのホモ二量体サブユニットであるR1およびR2(参考文献1、2、3)で構成されます。 R1は、ヌクレオチドの減少が起こるホモ二量体サブユニットです。 ヌクレオシド二リン酸基質と

正誤表:単一細胞のゲノム全体のコピー数分析

正誤表:単一細胞のゲノム全体のコピー数分析

元の記事は2012年5月3日に公開されました Nat。 プロトタイプ。 7、1024–1041(2012); 2012年5月3日にオンラインで公開。 2016年2月24日の印刷後に修正 最初に公開されたこの記事のバージョンでは、「試薬のセットアップ」セクションで説明したNSTバッファーのNaCl濃度の単位が正しくありませんでした。 正しい単位はmMです。 この記事のHTMLおよびPDFバージョンでエラーが修正されました。 著者 次でティモールバスランを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Jude Kendallを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Linda Rodgersを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Hilary Coxを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Mike Riggsを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Asya Stepanskyを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar でジェニファートロゲを検索:

マウスのゲノム不安定性スクリーニングのためのハイスループットin vivo小核アッセイ

マウスのゲノム不安定性スクリーニングのためのハイスループットin vivo小核アッセイ

科目 DNAの損傷と修復 フローサイトメトリー ゲノム不安定性 マウス 抽象 マウス赤血球におけるゲノム不安定性のマーカーである小核の形成を定量化するための高感度で堅牢なハイスループットな方法について説明します。 小核は、核から分離された染色体全体または染色体セグメントです。 他の検出方法は、労働集約的な顕微鏡ベースの技術に依存しています。 ここでは、フローサイトメトリーの経験豊富な研究技術者が実行するのに十分簡単な、小核スコアリングの2次元、96ウェルプレートベースのフローサイトメトリー法について説明します。 このアッセイは、25μlの血液を使用した古典的な表現型検査では容易に特定できない低レベルのゲノム不安定性を検出します。 このアッセイを使用して、10, 000を超える血液サンプルをスクリーニングし、脊椎動物のゲノム維持に寄与する新規遺伝子、ならびに新規疾患モデルおよびゲノム不安定性障害のメカニズムを発見しました。 統計的検出力の計算などの実験設計の考慮事項について説明し、トラブルシューティングのヒントを提供し、小核赤血球数の偽陽性増加と実験的変動に寄与する要因について説明します。 前書き 小核は、DNA二本鎖切断または有糸分裂紡錘体機能不全の結果として生じる可能性のあるクロマチンの核外セグメントです。 健康な細胞の有糸分裂中に小核が形成されることはまれであり、有糸分裂の完了時

基質活性スクリーニング(SAS):阻害剤発見のためのフラグメントベースの非ペプチドプロテアーゼ基質ライブラリーの調製およびスクリーニングの一般的な手順

基質活性スクリーニング(SAS):阻害剤発見のためのフラグメントベースの非ペプチドプロテアーゼ基質ライブラリーの調製およびスクリーニングの一般的な手順

抽象 基質活性スクリーニング(SAS)は、新規基質の迅速な開発と、CysおよびSerプロテアーゼの非ペプチド阻害剤への変換のためのフラグメントベースの方法です。 この方法は3つのステップで構成されます。(i)多様な低分子量 N- アシル基を持つ N- アシルアミノクマリンのライブラリーをスクリーニングし、単純な蛍光ベースのアッセイを使用してプロテアーゼ基質を特定します。 (ii)同定された N アシルアミノクマリン基質は、迅速なアナログ合成および評価により最適化されます。 (iii)アミノクマリンを既知のメカニズムに基づいたファーマコフォアで直接置き換えることにより、最適化された基質が阻害剤に変換されます。 このプロトコルは、 N- アシルアミノクマリン基質のライブラリーの固相合成のための一般的な手順と、弱い結合基質を識別するためのスクリーニング手順を説明しています。 前書き 「基質活性スクリーニング」(SAS) 1, 2, 3 と呼ばれる最初の基質ベースのフラグメント同定法を開発しました。 この方法は、フラグメントベースのスクリーニングにおける2つの重要な課題に対処します。(i)弱い結合フラグメントの正確かつ効率的な識別、および(ii)初期の弱い結合フラグメントの高親和性化合物への迅速な最適化 4, 5 。 この方法(図1)では、多様な低分子量 N- アシルフラグメントを含む N-

ウシクロム親和性細胞の初代培養

ウシクロム親和性細胞の初代培養

抽象 このプロトコルは、ウシ副腎の副腎髄質からの酵素消化によって得られた個々のクロム親和性細胞の一次培養について説明しています。 1970年代後半から、このような細胞は、カテコールアミン作動系での神経伝達物質の生合成、貯蔵、放出を研究するための有用なモデルシステムを提供してきました。 プロトコルは、細胞の分離(4〜6時間)、生細胞数の測定(約30分)、および培養中の成長(3〜7日)の3段階に分けることができます。 代替手順は、PC12などの連続クロム親和性(褐色細胞腫)細胞株で研究を行うことですが、そのような形質転換細胞は通常、初代細胞ほど高度に分化しません。 ウシのクロム親和性細胞の手順では、約1, 000〜2, 000万個の細胞が得られ、その後の3〜7日間のいくつかの実験に適しています。 典型的な実験には、伝達物質生合成、小胞貯蔵、エキソサイトーシス放出、分泌または転写に向けた刺激結合(シグナル伝達)、または超微細構造を含む形態が含まれます。 副腎採取から機能実験までの合計時間は、通常4〜8日です。 前書き クロマフィン細胞は、一般的な神経内分泌細胞およびノルアドレナリン作動性ニューロンのモデルとして広く使用されています。 実際、分泌装置の構成要素の構造と機能は、クロム親和性細胞とニューロンで非常に類似しているようです。 培養中の適度に均質なクロム親和性細胞を得る能力とその特徴的

PQS、HHQおよび関連する2-アルキル-4-キノロンクォーラムセンシング信号分子のバイオセンサーベースのアッセイ

PQS、HHQおよび関連する2-アルキル-4-キノロンクォーラムセンシング信号分子のバイオセンサーベースのアッセイ

抽象 2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロン(PQS)や2-ヘプチル-4-キノロン(HHQ)などの2-アルキル-4-キノロン(AHQ)は、クォーラムセンシングシグナル分子です。 ここでは、 ルクス ベースの 緑膿菌 AHQバイオセンサー株を採用するAHQ検出、暫定的な同定および定量化の方法について説明します。 このプロトコルでは、薄層クロマトグラフィー(TLC)とマイクロタイタープレートアッセイの両方について説明します。これらのアッセイでは、生物発光または緑色のピオシアニンを検出終点として使用します。 細菌細胞の有機溶媒抽出物または無細胞培養上清をTLCプレートでクロマトグラフィー処理し、乾燥させてAHQバイオセンサーで覆います。 AHQは、発光スポットと緑色のスポットの両方として表示されます。 マイクロタイターアッセイでは、使用済みの細菌培養上清または抽出物をAHQバイオセンサーを含む増殖培地に添加します。 光出力は、サンプルのAHQ含有量に比例します。 記載されているアッセイは、完了するのに約2日かかり、実行が簡単で、高度な機器を必要とせず、多数の細菌サンプルのスクリーニングに非常に適しています。 しかし、 緑膿菌の PQSおよびHHQを除いて、決定的なAHQ同定には追加のMSおよびNMR分析が必要になります。 前書き 細菌は、抗生物質やシデロフォア(鉄キレート剤)などの二次

染色体コンフォメーションキャプチャアッセイ(3C-qPCR)の定量分析

染色体コンフォメーションキャプチャアッセイ(3C-qPCR)の定量分析

抽象 染色体コンフォメーションキャプチャ(3C)テクノロジーは、数十から数百キロベースペアを含むスケール でin vivo ゲノム組織を探索できる先駆的な方法論です。 このスケールでのゲノムの折りたたみを理解することは、エンハンサーやインシュレーターなどの分散した調節要素が遺伝子調節に関与している哺乳類では特に重要です。 3Cテクノロジーでは、細胞のホルムアルデヒド固定に続いて、選択されたDNAフラグメントのペアが細胞集団で架橋される頻度のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの分析が行われます。 架橋頻度の正確な測定には、最高の定量化技術が必要です。 最近、リアルタイムTaqMan PCR技術を3Cアッセイの分析に適合させ、ゲル電気泳動によって分離された臭化エチジウム染色PCR産物の強度の測定に依存する現在の半定量3C戦略よりも架橋周波数をより正確に決定する方法をもたらしました。 ここでは、3C-qPCRと名付けたこのメソッドの詳細なプロトコルを提供します。 予備的な制御と最適化が実行されると、手順全体(3Cアッセイと定量分析)を7〜9日で完了できます。 前書き 哺乳類の遺伝子調節を理解するには、ゲノム構成に対する洞察が重要です。 しかし、技術的な制限により、遺伝子と分散した調節要素との間の長距離の物理的相互作用が最も頻繁に起こる規模(1〜10 3 kbp)で、哺乳類のゲノムが 生体

アフリカツメガエル卵の無細胞抽出物の生成と、ウェスタンブロットおよび走査型電子顕微鏡(SEM)用のin vitroで形成された核のアセンブリおよび分離のための脱膜精子クロマチン

アフリカツメガエル卵の無細胞抽出物の生成と、ウェスタンブロットおよび走査型電子顕微鏡(SEM)用のin vitroで形成された核のアセンブリおよび分離のための脱膜精子クロマチン

抽象 このプロトコルは、爪のあるヒキガエル アフリカツメガエル の卵と精子のクロマチンから、それぞれ無細胞抽出物とDNAテンプレートを生成する方法を詳しく説明しています。 ここで詳述するように、このシステムを走査電子顕微鏡(SEM)で使用して、真核生物の核膜(NE)と核膜孔複合体(NPC)の生合成の生化学的要件と構造経路を分析しました。 このプロトコルは、卵を産むように誘導される女性のカエル、および精子クロマチンの調製のために殺される男性のカエルへのアクセスを必要とします。 卵抽出物は1日で調製し、-80°Cで何ヶ月も保存できます。 膜分離された精子クロマチンは、調製に約2〜3時間しかかからず、-80°Cでほぼ無期限に保存できます。 インビトロ での構造的および機能的に適格な核の構築に必要な時間は、無細胞抽出物の品質に大きく依存するため、各抽出物の調製について決定する必要があります。 前書き アフリカツメガエル は、受精卵から生成された無細胞抽出物 がin vitroで 細胞周期イベントを再現する能力があるため、脊椎動物の細胞構造とプロセスの研究のためのモデル生物として使用されています 1, 2 。 生化学的操作に対する抽出物の使いやすさと組み合わされた生化学の力により、核再構築、核細胞質輸送、DNA複製、クロマチン処理 3, 4, 5, 6 などの多様なイベントに必要なメカニズムと

FACSベースの単一細胞ゲノミクスを使用して、培養されていない環境微生物からゲノムを取得する

FACSベースの単一細胞ゲノミクスを使用して、培養されていない環境微生物からゲノムを取得する

科目 環境微生物学 フローサイトメトリー ゲノミクス 全ゲノム増幅 抽象 単一細胞ゲノミクスは、環境微生物の遺伝的構造を調査するための強力なツールです。環境微生物の大部分は、不可能ではないにしても、現在のアプローチでは培養することが困難です。 ここでは、FACSによる高スループットの単一細胞分離を介して、培養されていない環境微生物からゲノムを取得するための包括的なプロトコルを示します。 プロトコルには、さまざまな環境サンプルの保存と前処理が含まれ、その後、個々の細菌および古細菌細胞の物理的分離、溶解、全ゲノム増幅、16S rRNAベースの同定が行われます。 説明されている手順は、標準的な分子生物学機器とFACSマシンで実行できます。 4日間で12時間未満のベンチタイムを要し、個々の微生物細胞から最大1μgのゲノムDNAを生成します。これは、PCR増幅やショットガンシーケンスなどのダウンストリームアプリケーションに適しています。 回収されたゲノムの完全性はさまざまで、平均で約50%です。 前書き 配列決定されたすべての細菌および古細菌ゲノムの大部分は、4つの細菌門のみに属し、微生物の遺伝的多様性 1の 見解を大きく歪めています。 この偏りは、ほとんどの微生物を培養することができないために部分的に生じます 2。 これは、従来の全ゲノム配列決定に必要なステップです。 培養に依存しないアプロ

コラーゲン誘発性関節炎

コラーゲン誘発性関節炎

抽象 コラーゲン誘発関節炎(CIA)マウスモデルは、関節リウマチの最も一般的に研究されている自己免疫モデルです。 自己免疫性関節炎は、フロイントの完全アジュバントとII型コラーゲン(CII)のエマルジョンによる免疫化により、このモデルで誘発されます。 このプロトコルでは、CIIの取得、処理、準備に必要な手順、マウス系統の選択、適切な免疫技術、関節炎の発生率と重症度の評価について説明します。 通常、関節炎の最初の兆候は、予防接種の21〜28日後にこのモデルに現れ、関節炎の手足の特定は難しくありません。 記載されているプロトコルを使用して、研究者は、遺伝的に影響を受けやすいマウスのさまざまな系統でCIAの高い発生率を再現可能に誘発し、病気の病理を批判的に評価する方法を学ぶことができるはずです。 試薬の調製と10匹のマウスの免疫化の合計時間は約1.5時間です。 前書き 自己免疫性関節炎の動物モデルは、この疾患の病原メカニズムの研究および新しい治療法の試験のための貴重な研究ツールであることが証明されています。 いくつかの関節炎のマウスモデルが確立されており 1 、抗原による免疫を必要とするものが含まれます-プロテオグリカン誘発関節炎(PGIA) 2 、連鎖球菌細胞壁関節炎 3 、CIA 4 および抗原誘発性関節炎 5 ; 化学物質によって誘発されるもの-オイル誘発性関節炎 6 ; および自発

ヒト多能性幹細胞からの脳オルガノイドの生成

ヒト多能性幹細胞からの脳オルガノイドの生成

科目 神経系の発達 神経発生 神経学的モデル 幹細胞の分化 抽象 人間の脳の発達には、モデル生物での研究が困難であることが証明されている、複雑さの増加やニューロン出力の拡大など、いくつかのユニークな側面が見られます。 その結果、人間の脳の発達と病気をモデル化するための in vitro アプローチは、研究の激しい分野です。 ここでは、内因性の発達プログラムによく似た、いわゆる脳オルガノイドと呼ばれる3D脳組織を生成するために最近確立されたプロトコルについて説明します。 この方法は、標準的な組織培養室で簡単に実装でき、1〜2か月以内に、大脳皮質、腹側終脳、脈絡叢、および網膜のアイデンティティを発達させることができます。 この簡単なプロトコルは、発達研究だけでなく、さまざまな人間の脳疾患の研究にも適用できます。 さらに、オルガノイドは長期培養で1年以上維持できるため、ニューロンの成熟や生存などの後のイベントをモデル化する可​​能性もあります。 前書き ヒトの発達と疾患をモデル化する in vitro 法は、幹細胞生物学の急速に拡大している分野の一部であり、主要な治療的意義があります 1 。 これらの3Dアプローチは、より正確な in vitro モデル 2, 3に つながる in vivo 発生イベントをより正確に再現するため、オルガノイドプロトコルはこれらの技術の最前線に立っています。

正誤表:ペプチド核酸ハンドルを使用したスーパーコイル環状DNAのテザー粒子分析

正誤表:ペプチド核酸ハンドルを使用したスーパーコイル環状DNAのテザー粒子分析

元の記事は2014年8月21日に発行されました Nat。 プロトタイプ。 9、2206–2223(2014); doi:10.1038 / nprot.2014.152; 2014年8月21日にオンラインで公開。 印刷後修正2014年9月12日 最初に公開されたこの記事のバージョンでは、図2、4、8、および9が適用されたソースは引用されておらず、正しくクレジットされていません。 この記事のHTMLおよびPDFバージョンでエラーが修正されました。 著者 Kamilla Norregaardを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Magnus Anderssonを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Peter Eigil Nielsenを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Stanley Brownを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Lene B Oddershedeを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar コメント コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同

マウス網膜単核食細胞の包括的な分析

マウス網膜単核食細胞の包括的な分析

科目 神経免疫学 網膜 抽象 自然免疫系は、加齢性黄斑変性症(AMD)などの多くの変性および炎症性網膜障害で活性化されます。 「網膜単核食細胞」と総称される網膜ミクログリア、脈絡膜マクロファージ、および動員された単球は、眼疾患の結果の重要な決定因子です。 多くの出版物が、網膜疾患のマウスモデルにおけるこれらの細胞の存在を説明しています。 ただし、それらの動作の限定された側面のみが明らかにされており、これらは単一の検出方法を使用してのみ明らかにされています。 ここで紹介するワークフローは 、in vivo および in situ での網膜単核食細胞の特性評価を可能にする包括的な分析戦略を説明しています。 MacGreenレポーターマウス(単核食細胞システム全体でマクロファージコロニー刺激因子受容体GFP導入遺伝子を発現するマウス)からのミクログリアのレーザー検眼鏡のスキャン、Iba1染色網膜切片およびフラットマウント、CD11bベースの網膜の定量分析の標準化された作業手順を提示しますフローサイトメトリー、および重要なミクログリアマーカーのqRT–PCR分析。 プロトコルは3 d以内に完了することができ、レーザー誘起脈絡膜血管新生(CNV)、明るい白色光曝露、およびFam161a関連の遺伝性網膜変性で治療された網膜からのデータを提示します。 このアッセイは、網膜障害の既存のマウスモデルの

低分子化合物ライブラリー向けのリン酸化化学物質(IMAP)ベースのハイスループットスクリーニングアッセイ用の固定化金属アフィニティの開発、検証、および実装

低分子化合物ライブラリー向けのリン酸化化学物質(IMAP)ベースのハイスループットスクリーニングアッセイ用の固定化金属アフィニティの開発、検証、および実装

抽象 このプロトコルは、リン酸化化学物質(IMAP)ベースの蛍光偏光(FP)および時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)ハイスループットスクリーニング(HTS)アッセイの自動化された固定化金属親和性のアッセイ開発、検証、および実装について説明します低分子量キナーゼ阻害剤。 両方の手順は、小型化されたキナーゼ反応ボリュームで実行され、テストまたはコントロール化合物、酵素、および基質/ ATPの段階的な添加を伴います。 キナーゼ反応は、その後のIMAP結合バッファーの添加により停止します。 IMAP FPおよびTR-FRET方法論のアッセイ属性について説明します。 これらの手順を使用して開発されたHTSアッセイは、堅牢なHTSアッセイに必要な Z 因子と低いアッセイばらつきをもたらすはずです。 必要な試薬と機器が用意されていれば、1人の科学者が384ウェルの小型HTSアッセイを6〜8週間で開発できるはずです。 特定の自動化されたHTSアッセイ条件によって、スクリーニングセッションで処理されるアッセイプレートの数が決まりますが、2人の科学者は1つの8時間のスクリーニングで100から150のアッセイプレートを処理することを期待します。 前書き ハイスループットスクリーニング(HTS)テクノロジーを使用して、大規模な化学ライブラリまたは生物学ライブラリを調べ、目的の生物学プロセスまた

正誤表:グリーン酸化および水素化プロセス用のコバルトベースのナノ触媒

正誤表:グリーン酸化および水素化プロセス用のコバルトベースのナノ触媒

元の記事は2015年5月21日に公開されました Nat。 プロトタイプ。 10、916–926(2015); 2015年5月21日にオンラインで公開。 印刷後修正2015年9月16日 最初に公開されたこの記事のバージョンでは、Box 1のタイトルが間違っていました。 正しいタイトルは「ニトロベンゼンを使用した触媒リサイクル実験:30時間」です。 この記事のHTMLバージョンとPDFバージョンで、エラーが修正されました(Box自体とタイミングセクションの対応するエントリの両方について)。 著者 次でRajenahally V Jagadeeshを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Tobias Stemmlerを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Annette-Enrica Surkusを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar でマティアスバウアーを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar Marga-Martina Pohlを検索: Nature Researchジャーナル• PubMed• Google Scholar JörgRadnikを検索